免疫熒光(IF)是一種用于可視化觀察細(xì)胞內(nèi)過(guò)程、狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的強(qiáng)大工具。 IF制劑可通過(guò)多種顯微鏡技術(shù)（如激光共聚焦、寬場(chǎng)熒光、全內(nèi)反射成像、基態(tài)淬滅顯微成像等）來(lái)加以分析，具體取決于應(yīng)用目的或研究人員的關(guān)注重點(diǎn)。 與此同時(shí)，在很多使用至少一套簡(jiǎn)易熒光顯微鏡的研究工作組當(dāng)中，IF早已成為重要的一部分。

IF實(shí)驗(yàn)的核心部分是兩種不同組分的組合：

◇ 首先是特異性抗體，用于形成免疫復(fù)合物來(lái)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)需要研究的分子，大多數(shù)情況下為蛋白質(zhì)。

◇ 其次是熒光色素，與免疫復(fù)合物耦合，因此可以用顯微鏡觀察目標(biāo)結(jié)構(gòu)。

圖 1： 圖中顯示了間接免疫熒光的典型工作流程，上皮細(xì)胞粘附在蓋玻片上生長(zhǎng)。 培養(yǎng)后細(xì)胞被固定，因此用化學(xué)交聯(lián)劑（如甲醛）將其殺死。 再用清潔劑進(jìn)行透化處理，使抗體穿過(guò)細(xì)胞膜。 用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白來(lái)進(jìn)行封閉，可減少抗體與非靶向結(jié)構(gòu)的非特異性結(jié)合，從而減少假陽(yáng)性信號(hào)。 接下來(lái)與一抗進(jìn)行孵育，特異性識(shí)別靶向分子上的表位。 在第二個(gè)培育步驟中，應(yīng)用熒光耦合二抗，與一抗結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向結(jié)構(gòu)的可視化觀察。 抗體孵育后，用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料進(jìn)行細(xì)胞核染色。 使用封固介質(zhì)（例如Mowiol或Prolong Gold）將蓋玻片封固在載玻片上后，IF即已準(zhǔn)備好進(jìn)行顯微鏡觀察。

直接與間接免疫熒光

根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型的不同，有兩種不同的IF變體可以使用： 第一種是直接IF或一級(jí)IF，一種具有特異性的一抗，能夠與熒光色素連接，用于結(jié)合靶向結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)直接可視化觀察。

第二種變體是間接或二級(jí)IF，這種變體需要采用兩步式培育。 首先，特異性一抗識(shí)別靶向結(jié)構(gòu)。 然后應(yīng)用與一抗特異結(jié)合的熒光色素耦合二抗。

這種特異性是通過(guò)引導(dǎo)二抗抵御產(chǎn)生一抗的物種而獲得的（見(jiàn)抗體和熒光色素章節(jié)）。 比較兩種IF變體可見(jiàn)兩者各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)：

通過(guò)耦合一抗和熒光色素，耗時(shí)的清洗和培育步驟被省略，所以直接IF比間接IF更快。 因此，直接IF更易于處理，適合于在標(biāo)準(zhǔn)IF實(shí)驗(yàn)中（例如在臨床實(shí)踐中）對(duì)樣本進(jìn)行快速分析。 但必須使用一種功能良好且對(duì)其抗原高度敏感的一抗。 這同時(shí)也是一個(gè)缺點(diǎn)，因?yàn)闊晒怦詈虾万?yàn)證的一抗成本較為高昂。 此外，每個(gè)靶向結(jié)構(gòu)都需要一個(gè)單獨(dú)的一抗，與間接IF相比，抗體與直接IF中的熒光色素的連接會(huì)限制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性。

這種靈活性是間接IF的顯著優(yōu)勢(shì)之一。 通常在IF反應(yīng)過(guò)程中，同一樣本都會(huì)有幾個(gè)不同的靶結(jié)構(gòu)需要實(shí)現(xiàn)可視化觀察，因此必須為每個(gè)靶向分子選擇一個(gè)離散的熒光色素。 在間接IF中，不同的熒光耦合二抗可以與不同的一抗結(jié)合（當(dāng)然還要考慮到物種的反應(yīng)性）。 相較之下，如果想在直接IF中對(duì)靶向結(jié)構(gòu)“玩"顏色組合，則需要為每一種顏色使用單獨(dú)的一抗。 間接熒光的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是二抗的信號(hào)放大。 多個(gè)二抗分子可與一個(gè)一抗結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng)，這意味可減少使用一抗。

間接IF的工作流程可能需要花費(fèi)更多時(shí)間，但由于一抗和二抗能夠組合而且整個(gè)操作過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性更高，因此間接熒光成為了絕大多數(shù)研究人員的方法。

有兩種方法通過(guò)免疫熒光顯示靶向結(jié)構(gòu)： 在兩種變體中，一種特異的一抗用于識(shí)別靶分子上的特定表位。

圖 2： 有兩種方法通過(guò)免疫熒光顯示靶向結(jié)構(gòu)： 在兩種變體中，一種特異的一抗用于識(shí)別靶分子上的特定表位。 在此圖中，靶分子由幾個(gè)相同的蛋白質(zhì)亞單位（=大分子）組成，因此會(huì)在每個(gè)亞單位上表現(xiàn)出幾個(gè)相同類(lèi)型的表位。 為方便簡(jiǎn)化，此處只描繪了一個(gè)表位。

直接IF中，一抗直接連接到熒光色素，在顯微鏡下觀察靶向結(jié)構(gòu)。

間接IF中，熒光耦合二抗在第二培育步驟中使用，從而專(zhuān)門(mén)對(duì)一抗進(jìn)行標(biāo)記。 因?yàn)槎鄠€(gè)二抗分子可以結(jié)合到一個(gè)一抗上，所以選擇抗體和熒光色素的靈活性更大，并能夠進(jìn)一步放大信號(hào)。

抗體和熒光色素

高質(zhì)量的IF染色當(dāng)中，最重要的工具是良好的一抗。 同時(shí)，幾乎每種細(xì)胞類(lèi)型中的每種蛋白質(zhì)都有一種或幾種市售抗體。 但此處需要強(qiáng)調(diào)若干重要注意事項(xiàng)。

要根據(jù)IF染色來(lái)做出精確的科學(xué)或臨床聲明，就必須確保一抗對(duì)其目標(biāo)抗原的特異性。 在操作中，研究人員不應(yīng)依賴(lài)商業(yè)供應(yīng)商的說(shuō)明。 應(yīng)根據(jù)之前的使用經(jīng)驗(yàn)以及文獻(xiàn)中確認(rèn)有效的一抗來(lái)進(jìn)行抗體選擇。 查看制造商網(wǎng)站上的抗體數(shù)據(jù)表，查看IF染色的可用圖片并與自身期望相比較，或者與其他已發(fā)布的插圖進(jìn)行比較。 注意抗體的克隆性，因?yàn)閱慰寺】贵w只與一個(gè)表位特異性結(jié)合，而多克隆抗體可識(shí)別多個(gè)表位，因此更有可能存在非靶向結(jié)構(gòu)的非特異性標(biāo)記。 所以，特異性較高且性能較優(yōu)的單克隆抗體通常更昂貴，但也能獲得更好的效果。

如希望開(kāi)展多色間接IF實(shí)驗(yàn)，則不同的一抗必須衍生自不同的物種，以便在之后通過(guò)熒光耦合二抗來(lái)區(qū)分免疫復(fù)合體（見(jiàn)表1）。 比如，您希望使用小鼠衍生的抗體抗蛋白A、兔衍生的抗體抗蛋白B和大鼠衍生的抗體抗蛋白C來(lái)實(shí)施IF檢查。 在選擇二抗時(shí)必須記住，每種抗體都只能特定識(shí)別一種一抗。 此外，在這三種二抗的例子中，熒光色素的波長(zhǎng)光譜必須不同，以便在顯微鏡分析中辨別熒光信號(hào)。 如今，可以買(mǎi)到與熒光色素相連的二抗，其波長(zhǎng)范圍從紫外線(xiàn)到紅外線(xiàn)，幾乎可以針對(duì)任何物種的一抗。 因此，研究人員目前僅受到現(xiàn)有顯微鏡（濾光片組、激發(fā)激光器）配置的限制。

表 1：此處的多色間接IF示例演示了如何在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)標(biāo)記三種不同的蛋白質(zhì)。

三種蛋白質(zhì)的一抗必須來(lái)自不同的物種，以便用三種不同的熒光色素耦合二抗來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。 二抗的熒光色素必須在波長(zhǎng)光譜上有所區(qū)分才能在顯微鏡下進(jìn)行不同的分析。 對(duì)示例圖像中描繪的細(xì)胞還使用Hoechst 33342進(jìn)行處理，完成了細(xì)胞核染色。 在Leica TCS SP2上進(jìn)行顯微鏡檢查。

樣本

IF方案存在于多種不同的樣本當(dāng)中。 簡(jiǎn)單常用的方法是對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)（真核）細(xì)胞進(jìn)行染色。 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞可以接種在蓋玻片上，采用多微孔插入或者直接接種在玻璃底培養(yǎng)皿上并在所需的時(shí)間用于IF檢查。 IF還可在細(xì)胞涂抹于載玻片（例如細(xì)胞離心涂片）后用于懸浮細(xì)胞的檢查。 在這兩種情況下，需重點(diǎn)分析細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程或結(jié)構(gòu)，這被稱(chēng)為免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)。

另一方面，在免疫組織化學(xué)

(IHC)typo3/中，通過(guò)組織特定的環(huán)境聯(lián)系來(lái)檢查是否存在蛋白質(zhì)或分子。 此處器官制備的超薄切片（通常包埋在石蠟中）用于比較研究健康器官與疾病器官中蛋白質(zhì)的表達(dá)。 除了制備組織切片外，還可以對(duì)整個(gè)生物體進(jìn)行IF檢查，這一過(guò)程被稱(chēng)為“整體IHC"。 為此可使用不同模式生物的胚胎如小鼠、雞或斑馬魚(yú)等，或植物模式生物如擬南芥。 在整體IHC中會(huì)受到樣本尺寸和相關(guān)IF試劑透化深度的限制。 單獨(dú)的孵育步驟比培養(yǎng)細(xì)胞的染色要長(zhǎng)。 此外還必須提供帶有特殊光學(xué)設(shè)備的顯微鏡用于大樣本分析。

圖3：a) 人類(lèi)腎臟的免疫組織化學(xué)(IHC)染色在不同的結(jié)構(gòu)中顯示了不同的細(xì)胞類(lèi)型（如腎小球、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管）。

綠色熒光色素標(biāo)記蛋白的表達(dá)僅限于特定的細(xì)胞類(lèi)型，而紅色標(biāo)記蛋白則廣泛表達(dá)。 b) 免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)圖像顯示間接免疫熒光對(duì)同一類(lèi)型細(xì)胞(MDCK)中的兩種蛋白質(zhì)的染色情況。

此處無(wú)法開(kāi)展組織特異性研究，但是如果兩種蛋白質(zhì)在同一個(gè)結(jié)構(gòu)中共定位則可以進(jìn)行分析。 對(duì)兩個(gè)樣本使用Hoechst 33342進(jìn)行處理，完成了細(xì)胞核染色。 在Leica TCS SP2上進(jìn)行顯微鏡檢查。

清洗步驟

在IF程序中應(yīng)特別注意清洗步驟，因?yàn)檫m當(dāng)?shù)那逑纯梢蕴岣?/span>IF質(zhì)量。 PBS是一種標(biāo)準(zhǔn)的清洗緩沖液，而PBS++或PBS-T等變體也很普遍。 PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2，推測(cè)其具有防止細(xì)胞分離的膜穩(wěn)定作用。 對(duì)于PBS-T，添加最終濃度為0.05%的清潔劑Tween 20，目的是增加抗體的結(jié)合特異性。 請(qǐng)務(wù)必注意小心地涂抹并吸取清洗緩沖液以免細(xì)胞從培養(yǎng)容器或蓋玻片上脫落。

如有足夠的時(shí)間，請(qǐng)?jiān)谖【彌_液時(shí)等待幾分鐘，以確保清洗緩沖液有效擴(kuò)散到樣本中。 IF程序的各個(gè)清洗步驟在下面的標(biāo)準(zhǔn)方案中列出。

傳統(tǒng)IF反應(yīng)的各步驟描述如下。 本文結(jié)尾附有常用的間接IF與培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)程序。

固定

固定是IF程序的第一步。

其目的是保持細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織處于其當(dāng)前狀態(tài)，并通過(guò)化學(xué)試劑長(zhǎng)期保存。 在固定過(guò)程中，重要的是細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持其原有的構(gòu)象。 不同的固定方法對(duì)IF有用，每種試劑對(duì)一抗表位有不同的影響。 抗體結(jié)合位點(diǎn)可能被掩蓋或被固定所破壞，這會(huì)損害IF染色質(zhì)量。 由于每種抗體以不同的方式與抗原結(jié)合依賴(lài)于不同的固定化合物，因此有必要嘗試新抗體的幾種固定方法。

通常，合適的固定劑規(guī)格可以在抗體的數(shù)據(jù)表上找到。 理想的固定應(yīng)能夠保存細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并為良好的抗體結(jié)合暴露出抗原。 實(shí)際上，您必須在兩者之間取得平衡。

固定試劑可以大致劃分成2組：化學(xué)交聯(lián)劑和有機(jī)溶劑。

化學(xué)交聯(lián)劑如通過(guò)游離氨基形成的福爾馬林交聯(lián)蛋白；細(xì)胞形態(tài)在大多數(shù)情況下保存良好。 但抗原也可能發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而可能減少抗體結(jié)合。 戊二醛對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有保存固定作用，但會(huì)導(dǎo)致顯微鏡下觀察到樣本有很強(qiáng)的自發(fā)熒光（見(jiàn)對(duì)照章節(jié)）。

有機(jī)溶劑如甲醇或丙酮等具有脫氫作用并沉淀蛋白質(zhì)，從而將其固定在細(xì)胞環(huán)境中。 但切記，在該過(guò)程中可溶性分子和許多脂質(zhì)成分都會(huì)丟失。

通常將甲醇和丙酮組合使用，因?yàn)楸M管甲醇適合保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但它對(duì)許多表位有極其不利的影響， 而丙酮卻破壞性較小。 除此還應(yīng)該考慮到，已存在于細(xì)胞中的熒光蛋白（如GFP）會(huì)因被有機(jī)溶劑固定而在很大程度上被破壞。 如果一抗的制造商未建議使用何種固定劑，則用4%福爾馬林在室溫下處理10分鐘即可用于各種細(xì)胞系和抗原。

表 2： 固定試劑。

透化

通過(guò)透化處理，抗體可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，否則抗體就無(wú)法通過(guò)細(xì)胞的脂膜。 根據(jù)固定類(lèi)型，有時(shí)需要單獨(dú)的透化處理。 用有機(jī)溶劑固定時(shí)，細(xì)胞膜已經(jīng)具有滲透性，您可以直接進(jìn)入封閉步驟。 用化學(xué)交聯(lián)劑固定的細(xì)胞需要用清潔劑進(jìn)行額外處理以實(shí)現(xiàn)透化。 使用Triton X-100或NP-40等傳統(tǒng)清潔劑，但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黃皂甙。 同樣，根據(jù)應(yīng)用的物質(zhì)、濃度和培養(yǎng)時(shí)間會(huì)得到不同的結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該在開(kāi)始時(shí)嘗試不同的參數(shù)。 典型的步驟是在室溫下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分鐘。

如果希望通過(guò)IF來(lái)分析脂質(zhì)相關(guān)蛋白或膜蛋白，則應(yīng)謹(jǐn)慎開(kāi)展透化步驟（=脂質(zhì)去除）。 比較理想的選擇是皂甙，能選擇性去除質(zhì)膜上的膽固醇，使細(xì)胞內(nèi)的膜基本上完好無(wú)損。 如果在抗體染色前忽略了透化處理（只能通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑固定），則可以專(zhuān)門(mén)標(biāo)記細(xì)胞外質(zhì)膜結(jié)合抗原，以便將其與胞內(nèi)抗原分開(kāi)來(lái)。 核酸染料如DAPI或Hoechst（見(jiàn)細(xì)胞核染色和樣本封固章節(jié)）具有膜滲透性，因此不需要透化處理。

封閉

封閉是在細(xì)胞內(nèi)最大限度降低一抗非特異性結(jié)合的重要步驟。 為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以使用來(lái)自牛血清白蛋白(BSA)、奶粉或血清中的蛋白質(zhì)。 關(guān)鍵在于，這些封閉蛋白質(zhì)并不源于產(chǎn)生一抗的物種，否則二抗對(duì)于一抗的特異性就會(huì)損失。 如果您使用的是二抗，如山羊產(chǎn)生的抗小鼠一抗，則理想的封閉試劑是正常的山羊血清。 通常使用濃度為1%（奶粉，BSA）至5%（正常血清）的封閉溶液，并在清洗緩沖液中稀釋。 在室溫下孵育30-60分鐘。

免疫反應(yīng)

經(jīng)固定、透化和封閉步驟制備樣本后，會(huì)開(kāi)始進(jìn)行免疫反應(yīng)。 樣本現(xiàn)在與特定的一抗一起孵育，以標(biāo)記所需的靶結(jié)構(gòu)。 幾種一抗可同時(shí)應(yīng)用于樣本。 如上所述，在間接多色IF中，幾種一抗必須來(lái)源于不同的物種。 首先根據(jù)制造商的要求，在選定的封閉溶液中進(jìn)行抗體稀釋。 如果對(duì)染色不滿(mǎn)意，或者如果制造商沒(méi)有提供任何關(guān)于有效稀釋的信息，您應(yīng)該嘗試使?jié)舛缺３衷?/span>1:50到1:1000之間。 根據(jù)抗體的親和力，孵育時(shí)間可能會(huì)有所不同。 默認(rèn)培育時(shí)間為室溫下1-2小時(shí)；也可以在4℃下過(guò)夜。

如果選擇直接IF，則可在一抗孵育后直接進(jìn)行封片，因?yàn)橐豢挂呀?jīng)帶有熒光色素。 在間接IF當(dāng)中，二抗現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)一抗進(jìn)行了熒光標(biāo)記。 這里的關(guān)鍵點(diǎn)在于使用一抗孵育后要充分清洗，以減少二抗的非特異性結(jié)合。 二抗也可以在封閉溶液或清洗緩沖液中進(jìn)行稀釋。 如果制造商沒(méi)有不同的指示，可以從1:200的稀釋開(kāi)始，在室溫下孵育1小時(shí)。 有必要避光培養(yǎng)以防出現(xiàn)熒光色素漂白。

細(xì)胞核染色與樣本封片

免疫反應(yīng)之后通常是用DNA染料對(duì)細(xì)胞核染色。 另一方面，在用顯微鏡觀察時(shí)這種處理可以更好地在細(xì)胞或組織切片內(nèi)進(jìn)行定向，同時(shí)還可以指示出細(xì)胞狀態(tài)（如有絲分裂）是否為研究所需的狀態(tài)。 即便在沒(méi)有透化的情況下也能進(jìn)入到細(xì)胞核并插入DNA中的染料，如Hoechst或DAPI等，可以用于此目的。 有鑒于此，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)當(dāng)十分小心，避免這些染料直接與皮膚接觸！ 室溫下簡(jiǎn)單的細(xì)胞核染色耗時(shí)大約10分鐘，期間Hoechst或DAPI需在PBS中稀釋。

完成IF步驟后，樣本必須適當(dāng)封片以便于開(kāi)展顯微鏡檢查。 有鑒于此，需要使用封固介質(zhì)（如Mowiol或Prolong Gold）將樣本固定在顯微鏡載玻片上并防止樣本脫水。 另外，封固介質(zhì)增加了折射率，有利于使用油浸物鏡進(jìn)行顯微鏡檢查。 一些制造商提供了帶有添加劑的封固介質(zhì)，如DABCO，這是一種防止樣本光漂白的防褪色劑。 根據(jù)使用的熒光色素，一些抗褪色劑比其他的更有效。 此外，還可使用添加了DNA染料的封固介質(zhì)以便在包埋期間對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，就無(wú)需進(jìn)行單獨(dú)的細(xì)胞核染色。 如果使用硬化封固介質(zhì)（通常情況下），則允許樣本過(guò)夜固化，因此可以在第二天進(jìn)行顯微鏡檢查。 以這種方式生產(chǎn)的玻片幾乎可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存在室溫或4℃的黑暗環(huán)境中，但請(qǐng)記住，熒光色素的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著時(shí)間的推移而減弱。

圖 4： 貼壁生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞（MDCK）在蓋玻片上培養(yǎng)、固定，細(xì)胞核用Hoechst 33342染色。 大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出間期DNA染色，但一些細(xì)胞出現(xiàn)染色體濃縮，這些染色體在有絲分裂中分離（星號(hào)）。 在徠卡TCS SP2上進(jìn)行顯微鏡檢查。

圖 5： 該圖展示了成纖維細(xì)胞（COS-7）當(dāng)中細(xì)胞微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的間接IF染色。 細(xì)胞核使用Hoechst 33342進(jìn)行染色并在Leica TCS SP2上開(kāi)展顯微鏡檢查。

對(duì)照

免疫熒光必須進(jìn)行適當(dāng)對(duì)照，以正確顯示顯微鏡圖像。 缺少或不適合的對(duì)照通常會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)論和不正確的數(shù)據(jù)。 首先應(yīng)當(dāng)分析只被固定、透化和封閉的樣本以便了解細(xì)胞間室的自發(fā)熒光typo3/。 有時(shí)即使沒(méi)有進(jìn)行IF染色，結(jié)構(gòu)也可能出現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(hào)。

為了進(jìn)一步的對(duì)照和調(diào)整間接IF的顯微鏡參數(shù)，使用已采用上述方法進(jìn)行處理過(guò)的樣本，但樣本還要額外使用二抗進(jìn)行孵育。 首先將揭示二抗與樣本的強(qiáng)非特異性結(jié)合。 其次，設(shè)置顯微鏡參數(shù)以便在該對(duì)照的圖像采集期間不記錄任何信號(hào)。 此設(shè)置用作后續(xù)采集的閾值來(lái)排除二抗的假陽(yáng)性信號(hào)。 在直接IF當(dāng)中，自體熒光對(duì)照用于調(diào)節(jié)閾值。 接下來(lái)分析與特異性一抗一起孵育的樣本，如果是間接IF，也分析與二抗一起孵育的樣本。 此時(shí)應(yīng)可檢測(cè)到熒光信號(hào)，其高于自發(fā)熒光和二抗的陰性對(duì)照。

為了確保一抗特異性標(biāo)記所需結(jié)構(gòu)，一些制造商為一抗提供可遮蔽特定抗原的肽封閉，從而防止抗體與其表位結(jié)合。 如此處理成本高昂，但也是確定抗體特異性的最佳方法，因此得到可靠的結(jié)果。 在多色IF實(shí)驗(yàn)中還必須注意所選熒光色素之間的串?dāng)_。 如果是第一次進(jìn)行多色IF檢查，建議在單獨(dú)的制備中另外染色靶向結(jié)構(gòu)，并將這些圖像與多色圖像進(jìn)行比較。 最后應(yīng)該仔細(xì)查看所獲得的數(shù)據(jù)并將其與您的期望和一抗的現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

表 3： 哪些對(duì)照測(cè)試哪些內(nèi)容？

局限性

如前所述，IF檢查有諸多優(yōu)勢(shì)，但同樣也存在著一定的劣勢(shì)。 關(guān)鍵點(diǎn)是樣本的固定： 固定意味著滅活，因此活細(xì)胞成像已變得不再可能。 因此對(duì)動(dòng)態(tài)過(guò)程的分析會(huì)比較復(fù)雜，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞都必須予以固定和染色。 所以快速動(dòng)態(tài)過(guò)程無(wú)法通過(guò)IF來(lái)進(jìn)行觀察。 這顯然是融合蛋白表達(dá)熒光標(biāo)記如GFP（綠色熒光蛋白）的優(yōu)勢(shì)，比較適合用于活細(xì)胞成像。 如上所述，IF實(shí)驗(yàn)過(guò)程中（固定/透化）會(huì)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此偽影可解釋為假陽(yáng)性信號(hào)。 所以有必要為每個(gè)IF染色準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)膶?duì)照品，可能很費(fèi)時(shí)。 另一個(gè)缺點(diǎn)同樣不可避免：熒光染料的光漂白。 像GFP這樣的熒光蛋白也受此影響，但當(dāng)儲(chǔ)存在適當(dāng)?shù)臈l件下，即使在幾個(gè)月的長(zhǎng)期制備后，GFP也能被檢測(cè)到。 相反，IF熒光色素的強(qiáng)度損失更快，這反映在顯微鏡下樣本的快速漂白。 即使是用抗褪色劑封固介質(zhì)也只能暫時(shí)起作用。

圖 6： 整套程序的流程圖。

標(biāo)準(zhǔn)IF流程

IF實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間：約5個(gè)小時(shí)。

這是一種蓋玻片上通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行固定的培育細(xì)胞接受間接IF檢查的標(biāo)準(zhǔn)方案。

◇ 濕盒非常適合IF實(shí)驗(yàn)，并且可以輕松完成自制（見(jiàn)幻燈片“如何制備濕盒"）。 該處理可防止試劑干燥并允許在黑暗中進(jìn)行培養(yǎng)，這對(duì)于處理熒光色素很重要，并且對(duì)于已經(jīng)存在的熒光蛋白是必要的。

◇ 試劑用量的選擇要確保蓋玻片能夠濕潤(rùn)。 確保樣本絕對(duì)不會(huì)太干燥。

◇ 所有培育步驟都在室溫下完成。

    ※ 清洗細(xì)胞兩次并使用鑷子小心地將帶有向上翻轉(zhuǎn)細(xì)胞的蓋玻片放入濕盒。

    ※ 使用4%福爾馬林進(jìn)行10分鐘的固定并清洗3次。

    ※ 使用0.1% TX-100/PBS進(jìn)行15-20分鐘的透化處理并清洗3次。

    ※ 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS進(jìn)行45分鐘的封閉（無(wú)需清洗）。

    ※ 在封閉溶液內(nèi)稀釋一抗并使用2小時(shí)（或在4℃下連夜使用）。 清洗4次將未結(jié)合的一抗清除掉。

    ※ 使用二抗進(jìn)行1個(gè)小時(shí)的孵育，在封閉溶液或清洗緩沖液內(nèi)進(jìn)行稀釋。

    ※ 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS中孵育10分鐘。 清洗4次，即便此時(shí)還沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞核染色。

    ※ 用鑷子輕輕取出蓋玻片并將其浸入dH2O 內(nèi)，清除掉清洗緩沖液的殘留鹽分。

    ※ 在顯微鏡載玻片上滴一滴封固溶液并將蓋玻片與細(xì)胞倒置這滴溶液上。 用鑷子輕輕按壓樣本，使封固介質(zhì)均勻分布而不會(huì)擠壓樣本。

    ※ 固化后就準(zhǔn)備好進(jìn)行顯微鏡觀察了。

配方

◇ 清洗緩沖液

    ※ 1 × PBS（磷酸鹽生理鹽水緩沖液）

    ※ 137 mM：NaCI

    ※ 2.7 mM：KCI

    ※ 10mM：Na2HPO4 

    ※ 1.8 mM：KH2PO4

◇ 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4

◇ 為PBS++，需添加最終濃度為1 mM的 CaCl2和MgCl2

◇ 如為PBS-T，需添加最終濃度為0.05%的Tween 20

固定緩沖液

◇ 福爾馬林：

    ※ 將4% PFA（多聚甲醛）溶解于溫暖（50-70℃）的dH2O中，pH值8（使用NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)）。

    ※ 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。

    ※ 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4。

◇ 甲醇（預(yù)先冷凍至-20℃）：

    ※ 100%甲醇（-20℃）

◇ 甲醇/丙酮（預(yù)先冷凍至 -20℃）：

    ※ 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）

透化緩沖液

◇ TX-100（Triton X-100)：

    ※ PBS，最終濃度0.1% TX-100

◇ 皂苷：

    ※ PBS，最終濃度0.1%的皂甙

◇ 其他清潔劑可在PBS中以相同濃度使用。

封閉緩沖液

◇ BSA（牛血清白蛋白）：

    ※ PBS，最終濃度為1% BSA

◇ 奶粉：

    ※ PBS，最終濃度為1%奶粉

◇ 正常血清：

    ※ PBS，最終濃度為5%正常血清

細(xì)胞核染料

◇ Hoechst或DAPI：

    ※ 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液，最終工作濃度為1 μg/mL。