半薄的部分，可從cryoprotected生物材料的冷凍塊切片在-90°C。徠卡冰凍切片機(jī)的使用這些路段的優(yōu)點(diǎn)是subcellullar形態(tài)保存和改進(jìn)的光學(xué)分辨率?；瘜W(xué)固定的生物材料是cryoprotected浸泡在2.3米，蔗糖和浸泡在液氮中冷凍到標(biāo)本引腳。切片是執(zhí)行與調(diào)整，切較厚部分（0.3至1μm）的ultramicrotome的厚度控制在低溫-ultramicrotome。一旦已取得的部分，他們是從使用蔗糖液滴的刀，但它們置于玻片上，而不是放在標(biāo)本電網(wǎng)。

 

　　玻片上應(yīng)注明對其中的部分將被放置標(biāo)記的玻璃，洗，然后外套的玻璃面的鉆石鉛筆。用洗滌劑和水清洗后，他們可能會涂要么明膠，聚-L-賴氨酸或阿爾辛藍(lán)。對于這些*，下降1％明膠被涂污在玻璃上使用的是第二張幻燈片和風(fēng)干的幻燈片。對于其他兩種方法，見下文。涂層的幻燈片，可確保部分粘在標(biāo)簽過程的幻燈片。

 

　　免疫標(biāo)記的玻片上的冰凍切片。

 

　　浸入幻燈片，與部分，成Coplin含有PBS JAR。這將洗去蔗糖。

 

　　浸入到用含50毫米氯化銨在為了解渴自由醛基的幻燈片。

 

　　浸入到PBS的幻燈片，包含阻斷劑（如1％明膠）。刪除的幻燈片，幻燈片等的部分和他們周圍的區(qū)域保持濕干表面。重要的是，部分沒有干出來的。

 

　　把加入10μl-20μL稀釋，離心抗體的上部分，在潮濕的氣氛中離開15分鐘到24小時。

 

　　抗體洗凈，用新鮮的PBS（一個Coplin JAR）。

 

　　重復(fù)抗體孵育和洗滌步驟與二級fluoresceinated抗體（步驟4和5）。

 

　　安裝在90％甘油的PBS的幻燈片，或沖洗水和含Moviol或Permount防褪色的化合物掛載。這將產(chǎn)生一個*性的裝載熒光信號是不容易漂白，當(dāng)暴露在紫外線下。

 

　　徠卡冰凍切片機(jī)與自體熒光的問題

 

　　如果所研究的材料是用戊二醛固定，然后自體熒光將出席。這可以由0.1％的PBS（pH值8）治療的部分被刪除。硼庫存解決方案，可以無限期地儲存在pH值12。在pH 7分子的半衰期為10秒。在pH 8的半衰期為100秒。

 

　　如果從組織的自體熒光，然后金或酶標(biāo)記的抗體可以取代二次熒光抗體。在這樣的抗體結(jié)合可以可視化使用銀增強(qiáng)揭示的黃金，或產(chǎn)生酶細(xì)胞化學(xué)在組織切片的彩色反應(yīng)產(chǎn)物。

 

　　聚-L-賴氨酸涂層玻片

 

　　在100毫升蒸餾水溶解聚-L-賴氨酸10毫克。

 

　　保留干凈，標(biāo)志著幻燈片，在這30分鐘的解決方案。

 

　　無論是空氣干燥，不洗或沖洗蒸餾水簡要。

 

　　阿爾辛藍(lán)玻片上的涂層。

 

　　0.5％阿爾辛藍(lán)原液

 

　　這個解決方案1:100用蒸餾水稀釋

 

　　在稀溶液中10分鐘，浸干凈，顯著的幻燈片。

 

　　簡要蒸餾水沖洗幻燈片。這洗之后，他們將繼續(xù)略帶藍(lán)色。

 

　　晾干后方可使用，并且只使用新鮮配制的幻燈片。