徠卡冰凍超薄切片技術(shù)
徠卡冰凍超薄切片技術(shù)是使樣品迅速冷凍，然后用冷凍切片機(jī)進(jìn)行徠卡冷凍超薄切片。它省去了普通超簿切片法中繁雜的化學(xué)固定與包埋操作，在細(xì)胞化學(xué)研究中有著特殊的用途。為了很好保存形態(tài)結(jié)構(gòu)，必須使游離水形成玻璃態(tài)的冰，防止產(chǎn)生冰晶。這就要求很高的冰凍速率（~度/秒），這對于傳熱性能差的生物材料來說是困難的。一般除了盡可能地提高冷凍速率外，還可考慮采用盡可能小的樣品尺寸（小于1立方毫米），對樣品進(jìn)行冷凍保護(hù)處理等，但通常也只能在樣品表面幾微米到幾十微米范圍內(nèi)能達(dá)到玻璃態(tài)。更深層將會(huì)因冷凍速率低而產(chǎn)生冰晶損傷。
1、儀器準(zhǔn)備
進(jìn)行冷凍超薄切片必須使用專門的
徠卡冷凍超薄切片機(jī)或配有
徠卡冷凍超薄切片附件的普通超曲切片機(jī)。德國生產(chǎn)
的LeciaCM3050S型和
LeciaCM1950凍切片機(jī)，可用于冷凍超薄切片。
2、醛類固定
戊二醛固定可良好保存結(jié)構(gòu)和生物大分子的活性，而且結(jié)合冷凍保護(hù)劑能有效防止冰品的產(chǎn)生。典型的固定液是：0.1M二甲胂酸鈉緩沖液（pH7．2）的2.5％戊二醛溶液，固定時(shí)間約1小時(shí)，固定溫度37℃。
3、包封
即用某些分子量較大的物質(zhì)將組織包埋起來，以便切出大面積平整的切片。這些物質(zhì)不滲入細(xì)胞內(nèi)部，只滲入細(xì)胞間隙，起臨時(shí)成形和支持作用。具體方法：將組織放在事先溶解好的20％的明膠溶液中保溫15—30分鐘，然后在冰箱中凝固，使樣品包封。也可以用甲基纖維索、牛血清蛋白等代替明膠，不進(jìn)行包封亦可以獲得較好的切片。
4、徠卡冷凍保護(hù)處理
在包封之后，將樣品放在30％~50％甘油中浸泡5~30分鐘，進(jìn)行冷凍保護(hù)處理。甘油效果較好，它不容易污染切片，具有濕潤作用，有利于切片。
5、徠卡快速冷凍
這是獲得高質(zhì)量冷凍切片的關(guān)鍵，常用的方法有三種：
①用液氮直接冷凍在樣品架上滴上一滴緩沖液，放上預(yù)處理過的樣品，一起直接放入液氮冷凍。這種方法如上述由于存在汽泡絕熱層，冷凍速率低，效果不佳。
②間接冷凍法采用某些低熔點(diǎn)，高沸點(diǎn)，高熱容量及傳熱好的中間冷媒，如：乙烷、異戊烷、丙烷、氟里昂等。將一金屬容器置于液氮中，再將中間冷媒注入容器中，待中間冷媒冷卻后，然后把樣品投入個(gè)間冷媒的容器中冷凍。由于這些冷媒不會(huì)沸騰和形成絕熱泡層，因此，冷凍速率高，效果較佳。
③金屑接觸冷凍法將一銅塊至于液氮中，待溫度平衡后，取出銅塊并將樣品與它接觸0.3~0.5秒，使樣品冷凍后，投入液氮中，繼續(xù)冷凍。此法出于樣品預(yù)先冷凍，樣品放入液統(tǒng)中不會(huì)產(chǎn)生絕熱的汽泡層，冷凍效果較好，特別適用于無溶液制備法。
6、切片
要進(jìn)行徠卡冰凍超薄切片首光必須熟練掌握普通徠卡常規(guī)超薄切片技術(shù)。在進(jìn)行切片之前要將樣品塊修整好。方法可用徠卡切片機(jī)修塊；也可在液氮中用一長柄刀片修整，但這兩種方法都不易掌握，效果不佳。較合適的方法是：將組織塊在戊二強(qiáng)固定的過程中，用刀片修整成適合于切片的梯形，并仔細(xì)放置在樣品架上進(jìn)行冷凍。
