奧林巴斯生物顯微鏡標本制備方法
奧林巴斯生物顯微鏡分散細胞是指非實體組織的細胞，它們單個分散的存在，如血細胞，胸、腹水中的細胞等。培養(yǎng)細胞雖不是分散細胞，但標本制各原則與分散細胞相似。奧林巴斯生物顯微鏡分散細胞懸浮于體液中，要使它們聚集，必須經(jīng)過離心，但離心力會損傷細胞，特別是破壞細胞的表面結構。如血小板在血中為盤狀，表面光滑，高速離心后，血小板變囚，表面出現(xiàn)許多突起，成為棘球狀。血小板內(nèi)部也有明顯改變，即血小板外形不規(guī)則，細胞器及顆粒聚集在血小板中心，被一束微管緊緊圍住，傲管與質膜之間有較寬裕的腦漿。這是血小板被澈話的形態(tài)學表現(xiàn)。離心可使靜止血小板激活。時間過長，速度過高的離心還會使血小板質膜破裂，細胞器溢出。因此，在制備分散細胞標本時，在離心前固定。此外，由于分散細胞懸浮于體液中，將細胞固定后的蛋白質一同固定，而且這些固定后的蛋白小凝塊附著在細胞表面，遮蓋細胞表面細微結構，妨礙觀察。因此必須沖洗充分。此外，必須使分散細胞附著在一個表面上進行脫水、干燥等操作。這幾個問題是制理分散細胞掃描電鏡標本的特殊問題。下面對奧林巴斯生物顯微鏡分散紉胞掃描電鏡標本制備方法詳細分步敘述：
1．奧林巴斯生物顯微鏡固定：只用戊二醛固定便能收到很好的效果，但要兩次固定，在*次固定前需使細胞在類似體液的條件下，保持體內(nèi)的形狀。由于血細胞、旗水細胞等在取出時經(jīng)過穿刺針的紉孔而變形，必須設法使細胞于固定前恢復為原來形狀，才能在電鏡下看到真實的細胞形態(tài)?，F(xiàn)以紅細胞及血小板為例，詳細說明如下：
（1）奧林巴斯生物顯微鏡紅細胞：
將1滴血（一般取靜脈血為好，手指或耳垂取血時由于擠壓往往使細胞嚴重變形而損傷細胞）放到（5—6）m1磷酸鹽緩沖液中。緩沖液pH為7．2—7．4，370C，滲透壓為Ho毫滲（即與正常人血漿滲透壓相等）。
（2）
奧林巴斯生物顯微鏡血小板：取靜脈血10m1，放入塑料或硅化的玻璃試管中。用構撤酸鈉或肝家抗凝，離心[（900一1100）轉／分，10分鐘]，用塑料吸管或硅化的玻璃吸管將富血小扳血漿（PRP）吸出并轉移至另一塑料試管或硅化的玻璃試管中，PRP約3—4創(chuàng)，376c溫育15分鐘，目的是使血小板恢復為正常的形態(tài)。加入戊二醛（硝釀鹽或二甲肺酸鈉緩沖液，PH7．2—7．4），使?jié)舛葹閛．25％。在37。c下繼續(xù)溫育15分鐘，以完成*次固定。胸、腹水細胞以及其它體液中的細胞標本制備方法與以上列舉的兩例類似，培養(yǎng)細胞的標本制備原則也應該是先預固定后再離心集中。具體做法是在培養(yǎng)液加入戊二醛，同樣，濃度為o．25％，15分鐘后，用橡皮鏟將細胞取出，離心。低濃度戊二醛使細胞初步固定，再經(jīng)離心集中便不會使細胞嚴重損傷，但離心力仍不能過大，時間也不能過長。如紅紉胞為（900一1100）轉／分，8分鐘；血小板為xoo轉／分，lo分鐘。離心后棄上清，在細胞沉淀中加入2％戊二醛，用吸管反復歡打，使細胞分散。于室溫下再固定30分鐘。如果對同一種細胞在觀察其表面結構的同時還要觀察內(nèi)部結構，即需分出一半制做超薄切片標本．則*次固定所用的戊二醛濃度可稍大些，可用o．5％G將細胞離心集中后，取出一半直接用心四氧化餓固定即可。
2．奧林巴斯生物顯微鏡清洗：清洗的目的是除洗去固定液外，還要將細胞分散，即將細胞分成一個個散在的細胞。還要把經(jīng)戊二醛固定后體液中的小蛋白質凝塊洗去，并使這些蛋白質凝塊脫離細胞表面，以免遮蓋細胞表面超微結構。因此，清洗這一步驟十分重要，需注意以下幾點：
（1）清洗所用的水必須十分清潔，預先經(jīng)微孔濾膜過濾以除去水中的細菌及顆粒雜質。
（2）清洗時需用力吹打，多次昧打，每次清洗用液量在8mI以上。需清洗三次。
（3）清洗用液是雙藥水，而不用緩沖液。因緩沖液中的鹽可能在脫水時析出并粘在細胞表面，使標本污染。
（4）每次吹打后需將已用過的滴管洗凈，用過濾的雙蒸水沖凈后第二溫清洗時再用*不然會有些細胞鉆附滴管壁上，放置室溫下便自然干燥。這些自然干燥后的細胞若進到標本中則影響標本質量。
（5）每次清洗后需離心，離心時間不能過長，離心力不可太大。因為離心的目的是使細胞沉降，而小蛋白凝塊仍懸浮于上清液中，與清洗液一同棄去。
3．奧林巴斯生物顯微鏡脫水與樣品附著：由于多次離心使細胞丟失，因此先將細胞附著在玻片或塑料片表面，使細胞隨同該進片或塑料片一起脫水、干燥。為使細胞能附著在玻片或塑料片，需先在玻片或塑料片上鋪設一層膜。鋪膜方法如下：
（1）zui簡單的方法是鋪一層薄的聚乙烯醇縮甲醛（for帥）膜。將洗凈的玻片在（o．5—1）％聚乙烯醇紹甲醛氯仿溶液中浸蘸，待氯仿?lián)]發(fā)后玻片上呈現(xiàn)一層白膜，將玻片在氯仿中振蕩幾次使膜變薄即可用。
（2）將o．1％多聚L一賴氨酸（制備時將1mg多聚賴氨酸溶于lml過濾后的水中）墑在洗凈的玻片上，待液滴展開后在45。c烘箱中干燥。此種方法，因為多聚l—賴氨酸帶正電荷，能使較多的表面帶負電荷的細胞附著。
（3）將血漿和甘油各以（30一40）％，和（3—5）％的比例加到蒸餾水中，成為甘油蛋白濃。將該液滴在洗凈的玻片上，展開并烘干。將鋪好的蛋白膜浸入2％戊二醛中使蛋白固定，洗凈后干燥可備用。使用前將血漿滴在該蛋白膜上使之“活化”．30分鐘后用緩沖液沖淡，便可直接應用。
奧林巴斯生物顯微鏡將固定與清洗后的細胞用過濾后的水制成濃度適宜的細胞懸濃，懸滴在已鋪好膜的玻片或塑料片上，在濕潤、低溫（40c）環(huán)境中放置（30一120）分鐘，使細胞附著到膜上。用細鑷子夾起玻片在清潔的雙蒸水中振蕩，洗去末附著的細胞。然后迅速故人盛有50％丙損（或乙醇）的器皿中。脫水過程是將玻片每隔約3分鐘，依次故入濃度遞增的丙酮或乙醇中，或在放玻片的器皿中不斷增加脫水劑濃度。據(jù)作者所在實驗室經(jīng)驗，后一種操作比較方便。具體做法可每隔3分鐘將器皿中的脫水劑吸出一半，再加入濃度為loo％的等量脫水劑。經(jīng)過5—6次操作，器皿令脫水劑濃度達99．5％以上。細胞脫水成功。臨界點干燥后將玻片或塑料片用導電膠粘于樣品墩上進行金屈鍍膜。
奧林巴斯生物顯微鏡利用第三種方法鋪設的膜附著細胞也有方便之處?？蓪⒔?jīng)低濃度戊二醛固定后的細胞懸滿在“活化”后的蛋白膜上，放置10分鐘，將玻片或塑料片浸于2％戊二醛中，30分鐘后用過濾雙蒸水沖清，再按上述方法脫水、干燥及金屬鍍膜。
